В начале этого раздела напомним очень коротко исто-
рию возникновения культуральных моделей: культуры тка-
ней и клеток. В период становления этих прогрессивных
АБМ при слишком прямолинейном и категоричном понимании
их использования они внедрялись с большим трудом, а в
некоторых направлениях отечественной медицины полностью
отрицались. Когда же за рубежом получили первую переви-
ваемую клеточную культуру Hela (1951 г.), характеризую-
щуюся неограниченным сроком жизни, то эти эксперименты
отнесли к чему-то, сходному с алхимией. Hela - произ-
водное от имени и фамилии донора Henrietta Lacks.
Несмотря на неограниченные возможности культуральных
методов, до сих пор в нашей стране многие специалисты в
сфере медицины и смежных областей, ставящие эксперимен-
ты на животных и на человеке, но далекие от практики
использования АБМ, фразу "in vitro" воспринимают как
призыв к полной замене подопытных животных во всех сфе-
рах науки и практики, на всех уровнях. На самом деле,
так вопрос никогда не стоял.
Существование культивирования органов, тканей и кле-
ток вне организма отметило уже свое столетие. Первые
теоретические основы метода были сформулированы у нас в
России в в 1874 г. А. Б. Голубевым [32], а эксперимен-
тальное воспроизведение культивирования клеток крови в
искусственной среде предпринято И. П. Скворцовым в 1885
г. [33].
Начиная с 1907 г., приемы культивирования тканей на-
чали быстро развиваться благодаря работам Гаррисона
[34], которые ознаменовали начало практического приме-
нения методов in vitro. При соблюдении строжайших сте-
рильных условий автор наблюдал возможность продления
функций вне организма кусочков ткани, полученных из ме-
дуллярной трубки эмбриона лягушки. Кусочки, помещенные
в сгустки лимфы лягушки, выживали в течение ряда не-
дель, при этом из клеток вырастали аксоны [34].
В наибольшей степени развитие культивирования клеток
обязано Каррелю [35], удостоенному Нобелевской премии
за работу в экспериментальной хирургии. Обладая знания-
ми правил асептики, Каррель подошел к культивированию
тканей и клеток как к хирургической операции, благодаря
чему ему удалось сохранить у клеток способность
размножаться в условиях in vitro в течение продолжи-
тельного времени [35]
Из-за скрупулезной хирургической техники, стерильных
условий работы специалисты других медико-биологических
дисциплин долгое время считали, что культивирование
тканей и клеток является фантастически трудоемким. Пос-
тепенно все "алхимические" представления рассеивались.
Со временем многие затруднения были устранены за счет
создания питательных сред, содержащих практически все
вещества, необходимые для роста клеток, культивирования
органов и тканей в условиях in vitro. Были разработаны
простые методы выделения первичных клеток, селекции
клонов и хранения культуральных моделей. В настоящее
время созданы многочисленные банки с замороженными в
них клеточными линиями разного вида и происхождения. В
современных условиях культивируют in vitro с одинаково
высокой эффективностью все типы клеток человека, живот-
ных, рыб, насекомых, растений [1, 2, 28, 36, 37].
Как мы уже говорили, в последние десятилетия очень
обострились споры относительно проверки токсичности ле-
карственных средств, продуктов питания, косметики, во-
ды, факторов загрязнения окружающей среды, опасность
которых изучена только на животных. В связи с этим про-
изводители тех или иных изделий народно-хозяйственного
значения стали также проявлять беспокойство по поводу
не только затрат и других трудностей, связанных с испы-
таниями на животных, но и с реализацией такой продук-
ции. В ответ на эту озабоченность специалисты разных
направлений медицины и биологии стали активно внедрять
АБМ [1-7, 10, 12-14, 16, 17, 23, 24, 27-31].
Терминология. Различают культуральные модели трех
видов: органные, тканевые и клеточные. Однако, строго
говоря, трудно разделить понятия "органных" и "ткане-
вых" культур, поскольку in vitro выращивают отдельные
участки или целые фрагменты органов: печени, почек, пи-
щевода, шейки матки, щитовидной и молочных желез, кожи,
зачатков эмбриональных органов и, наконец, целиком эмб-
рионы [1, 2, 36-38]. Доказано, что такие компоненты,
как паренхима и строма, их анатомическая взаимосвязь,
функционируют в культуре подобно тому, как это происхо-
дит в условиях целого организма (in vivo) - "все про-
цессы чрезвычайно похожи" [1, с. 214]. Так, эпителий в
присутствии стромы растет, дифференцируется и продуци-
рует специфические секреторные белки. Предстательная и
молочные железы, матка (органы, зависимые от гормонов)
сохраняют чувствительность к гормонам и способны реаги-
ровать на них in vitro. Фрагменты эндокринных органов -
яичников, семенников, надпочечников и гипофиза - про-
должают секретировать in vitro специфические гормоны.
Так производятся гормональные препараты.
Так что же, органно-тканевые культуры могут пол-
ностью заменить животных в эксперименте?
Конечно, нет. Только там, где это возможно. Право-
мерность их использования зависит от целей и задач на-
меченных исследований. Например, культивирование подоб-
ных моделей не превышает нескольких месяцев. Если срав-
нить с организмом человека, то такой промежуток времени
слишком короток для возможности изучения хронического
воздействия внешних факторов - воды, воздуха или дли-
тельного приема лекарственных средств. Есть и другие
причины [1, 2, 17-20]. С другой стороны, результаты,
подученные на органно-тканевых культурах, могут служить
разгадкой многих событий, происходящих в целом организ-
ме, и тем самым сократить значительное количество жи-
вотных в опытах. Эту точку зрения подтверждают данные,
полученные при наиболее трудоемких - нейрофизиологичес-
ких - исследованиях, согласно которым: "...культура ЦНС
- "окно в мозг" ...окно открыто для всех, кто хочет
наблюдать "волшебный ткацкий станок узоров", которые
могут служить ключом к проникновению и пониманию кле-
точных механизмов, лежащих в основе наиболее важных ас-
пектов нормальных и патологических функций нервной сис-
темы" [38, с. 290]. По мнению нейрофизиолога П. К. Ано-
хина [20], культура клеток нейронов в условиях in vitro
при нейрофизиологических исследованиях всегда на нес-
колько десятков лет опережает довольно простенькие ма-
тематические модели.
Культура клеток (ККЛ) - наиболее широко используемая
АБМ. Получают ее из кусочков ткани, диспергированных с
помощью про-теолитических ферментов или путем спонтан-
ной миграции клеток из эксплантата [1, 34-38]. Клетки
in vitro размножаются в суспензии или в монослое, прик-
репившись к субстрату - стеклу, пластику.
ККЛ может быть: - первичной, делящейся всего нес-
колько раз в условиях in vitro, живущей не более 5-8
пассажей, т. е. приблизительно 5-6 недель, сохраняя ис-
ходные свойства донора; - диплоидной - полуперевивае-
мой, также с ограниченным сроком жизни, но значительно
превышающим первичные; пересеваются (обновляются) каж-
дые 3-5-е сутки, культивируются 45-55 пассажей, т. е.
поддерживаются в условиях in vitro 5-6 месяцев, сохра-
няя свойства донора; - перевиваемой (постоянной, ста-
бильной); все перевиваемые клеточные линии, подобно He-
la, с неограниченным сроком жизни при регулярном пере-
севе их через каждые 7-10 дней. Выбор названных ККЛ за-
висит от целей и задач исследований.
Многолетние теоретические изыскания в комплексе с
практическими разработками привели к тому, что совре-
менная международная классификация [30, 43] рассматри-
вает АБМ как подтверждающие тесты, т. е. полностью иск-
лючающие животных из эксперимента; дополнительные -
резко сокращающие число подопытных животных, помогающие
получать достоверные результаты до экспериментов на жи-
вотных; комплементарные - единственная биологическая
модель, воспроизводящая и прогнозирующая первичные пов-
реждения, происходящие на уровне клеток в организме под
воздействием вредных факторов. Патологические процессы,
обусловленные первичным повреждением клеток, определя-
ются разными способами: обычным световым или сканирую-
щим микроскопированием, цитохимически, биохимически и
др. [1-6].
По мере развития культуральной техники появилась
уникальная возможность для развития фундаментальных
исследований в области патологии клеток, в цитогенети-
ке, акушерстве, иммунологии, геронтологии, наконец, ис-
кусственном оплодотворении - "человек из пробирки" [28,
44-46, 49].
Результаты на моделях in vitro получают значительно
быстрее, чем на целом организме животных [1-7, 12, 13,
17, 28, 37], а при необходимости им дают не только ка-
чественную, но и количественную оценку, "обеспечивая
воспроизводимость и достоверность результатов" [1, с.
253]. Стало совершенно очевидным, что "высокая чувстви-
тельность и хорошая воспроизводимость тестов на клеточ-
ных системах in vitro, возможность одновременного ка-
чественного и количественного учета результатов, делают
эти культуральные модели "идеальными лабораторными жи-
вотными" [47, с. 275). Такое понимание потенциально не-
ограниченных возможностей каждого теста in vitro служит
основой для исключения рассуждений о нереальной замене
или сокращении наших братьев меньших в эксперименте.
Нужно лишь определиться в назначении моделей и методик
in vitro, что зависит не только от области применения,
целей и задач, но в самой большой степени от нравствен-
ных устоев экспериментатора.
Во многих государствах созданы национальные банки
данных [11-13, 48], чтобы не дублировать ненужных опы-
тов in vivo. В банке сохраняются отчеты и об отрица-
тельных результатах тестирования различных веществ. Бо-
лее того, отрицательные данные регистрируются как па-
тенты, дабы не предпринимать повторных неудачных попы-
ток [48].
Возрастание значения культивируемых клеток находит
отражение в резко увеличивающемся количестве публика-
ций, в появлении специализированных периодических изда-
ний [1-3, 11-14, 20, 28, 29, 36, 37-43].
Сочетая исследования in vitro, на животных и клини-
ческие испытания, можно добиться более глубокого пони-
мания механизма действия малых, но токсичных доз, более
тщательного отбора лекарственных средств, улучшая ре-
зультаты лечения. "Если клетку рассматривать как неза-
висимый объект эксперимента, то одна культура даст бо-
лее достоверный ответ, чем целая клиника, полная боль-
ных. Это является важным преимуществом, когда дело ка-
сается человека, и, кроме того, снимает многие этичес-
кие проблемы, возникающие при необходимости использо-
вать для эксперимента большую группу животных" [37, с.
9].
Культура клеток на службе здоровья человека,
животных и окружающей среды
Принято считать, что использование АБМ является сви-
детельством высокого уровня эксперимента: этично, эко-
номично, экспресс-тест in vitro.
ККЛ в вирусологии применяют в качестве субстрата,
инструмента и продуцента; подтверждающего, дополнитель-
ного и комплементарного тестов. Вирусы, как известно,
размножаются исключительно в живых клетках - клетках
человека, животных, растений, рыб, насекомых и т. д.
Серьезность и важность появления этой АБМ, заменяю-
щей и резко сокращающей подопытных животных в вирусоло-
гии, отмечена на очень высоком международном уровне. В
1954 г., когда в США борьба с полиомиелитом была в пол-
ном разгаре, Нобелевская премия по физиологии и медици-
не была присуждена Д. Эндерсу, Ф. Роббинсу и Т. Уэллеру
за разработку метода размножения вируса полиомиелита
вне организма обезьян, в ККЛ. Полиомиелит - печальная и
трагичная "привилегия" заболевания человека, чаще всего
- детей. Тем не менее премия была присуждена не Д. Сол-
ку и А. Сейбину за вакцину против этого страшного ви-
русного заболевания, а за метод выращивания клеток in
vitro для культивирования в них вирусов полиомиелита.
Самое главное в производстве любой вирусной вакцины
- ККЛ и асептические условия работы. "Культура" - воз-
делывание, получение большого количества клеток. ККЛ,
разработанная впервые американскими исследователями для
вирусологических работ, явилась прежде всего субстратом
для размножения и накопления большого количества вирус-
ной массы. После получения необходимого количества ви-
руссодержащей жидкости, отвечающей определенным требо-
ваниям для последующего приготовления из нее вакцины,
работа ведется над изготовлением самого препарата [4,
5, 18, 26, 36, 40]. Следующий этап, когда ККЛ использу-
ется в качестве инструмента, оценивающего безопасность
и активность полиовакцины. И если бы готовая убитая
(инактивированная) или живая вакцина обладала токсичес-
кими свойствами, подобно отечественной антибактериаль-
ной АКДС (ассоциированная, К-коклюшно, Д-дифтерийно, С
- столбнячная), то убивала бы саму модель - клетки в
культуре. Такое свойство исключало бы возможность исс-
ледования основных показателей качества полиовакцины.
Абсолютно недопустимо добавление в биопрепараты ка-
ких-либо антибактериальных химических веществ, подстра-
ховывающих стерильность в процессе их изготовления.
Стерильность вакцин не должна и не может достигаться в
конце XX века посредством введения в них заведомо ток-
сичных добавок типа ртутных солей [4, 5, 26]. Из реко-
мендаций ВОЗ известно [18]: "...формальдегид в пробах
полиовакцины, предназначенных для испытания в клеточных
культурах, может проявлять токсическое действие даже
при разведении 1 мл препарата 1:4".
Согласно нашим данным [4, 5, 2б], полученным в мно-
гочисленных комплексных исследованиях с генетиками и
иммунологами, одноразово инъецируемая доза АКДС (0,5
мл) убивает клетки в культуре при ее разведении в
100... 1000 и более раз! Вместе с тем инфекционное на-
чало в АКДС убито тем же инактиватором - формалином.
Время создания препаратов совпадает, а вот культура
производства не имеет ничего общего: в АКДС введена вы-
сокотоксичная химическая добавка - ртутьоргани-ческая
соль, а полиовакцина максимально освобождена от бал-
ластных веществ.
Опыт, накопленный международной практикой в течение
последних 35 лет [18], показал, что ККЛ является высо-
кочувствительной тест-системой (полная замена животных)
для выделения из убитой вакцины случайно оставшегося
патогенного агента. Такой остаток должен быть полностью
исключен, поскольку последствия чреваты заболеванием, а
не вакцинацией. Поэтому для более высокой гарантии
обезвреженности готового продукта подбирают чувстви-
тельную ККЛ и вводят в нее определенный объем вакцины.
Наличие в вакцинах токсичных химических веществ исклю-
чает применение этого метода.
Отечественным вариантом вакцины против вирусов полиоми-
елита мы обязаны всемирно известному вирусологу, нашему
соотечественнику, академику М. П. Чумакову, организо-
вавшему в начале 50-х годов Институт по изучению полио-
миелита (сейчас Институт полиомиелита и вирусных энце-
фалитов им. М. П. Чумакова). Именно он направлял всю
работу по разработке и внедрению ККЛ в бывшем СССР. Не
было бы ККЛ, не была бы приготовлена вакцина против по-
лиомиелита, кстати, единственная отечественная вакцина,
отвечающая по многим параметрам международным требова-
ниям. В данном случае ККЛ приобрела особую значимость
при налаживании производственных масштабов наработки
вирусов. Результаты труда М. П. Чумакова в этом направ-
лении огромны еще и потому, что ККЛ в отечественной ви-
русологии - ощутимый фундамент, позволивший не одно де-
сятилетие советским вирусологам общаться с зарубежными
коллегами на одном уровне.
Продолжительное время у нас, у вирусологов, были ог-
раниченные возможности для проведения исследований.
Трудоемкая работа с лабораторными животными давала до-
вольно ограниченную информацию о вирусах. Многое изме-
нили куриные эмбрионы, заменившие на определенном эта-
пе, а где-то сократившие значительное количество живот-
ных в вирусологии. ККЛ сыграла неоценимую роль: выделе-
ние, идентификация, открытие новых вирусов.
Культуро-клеточная вирусология постепенно обогаща-
лась методами химии, физики, биофизики, цитохимии, ге-
нетики, молекулярной биологии, иммунологии и иммунохи-
мии. Диагноз многих вирусных заболеваний значительно
упростился и стал составной частью эффективной врачеб-
ной практики.
Клинические исследования и другие задачи чумы XX ве-
ка - ВИЧ-инфекции также решаются с помощью ККЛ.
Экологическая экспертиза санитарной вирусологии,
надзор за возбудителями инфекционных заболеваний значи-
тельно облегчен и удешевлен за счет этой АБМ: контроль
за объектами окружающей среды, и в первую очередь за
открытыми водоемами, сточными водами, питьевой водой,
почвой и воздухом, овощами и пищевыми продуктами нерас-
тительного происхождения - вирусы в них не размножают-
ся, но сохраняются и циркулируют до момента попадания в
живую клетку.
ККЛ как комплементарный тест помогает изучать много-
образие форм вирусоносительства, взаимодействия вирусов
с клетками разных видов и типов.
Благодаря ККЛ вирусология приобрела статус одной из
самых комплексных дисциплин, эволюционная цепочка кото-
рой состоит из трех модельных этапов: животные, куриные
эмбрионы и ККЛ.
ККЛ в токсикологии используется с теми же целями и
задачами, что в вирусологии. Тесты могут быть подтверж-
дающими, дополнительными и комплементарными. Техника
проведения эксперимента абсолютно идентична вирусологи-
ческим методам [1, 4]. Результаты оцениваются по степе-
ни цитотоксического действия (ЦТД) в ККЛ. Эта модель
пригодна здесь также не только для определения актив-
ности бактериальных токсинов, подобно вирусам, но и для
индикации остаточных количеств в вакцинах и анатоксинах
[4, 18, 50]. Причем, in vitro выявляется минимальное
количество токсинов, например, дифтерийного (ДТ), дейс-
твие которых нереально уловить в организме морских сви-
нок, используемых в работе с ДТ. ККЛ позволила изучить
взаимодействие этих "нетоксичных" доз ДТ с клеточными
рецепторами, что, в свою очередь, установило ряд зако-
номерностей, доказывающих опасность таких доз для орга-
низма человека. Повторный контакт с ними приводит к по-
вышению чувствительности человека и к усилению токси-
ческого эффекта.
Применение ККЛ как высокочувствительного метода осо-
бенно важно при оценке специфической безопасности диф-
терийных анатоксинов, входящих в состав АКДС и ее раз-
личных модификаций. По нашим данным [4, 50] самой высо-
кой степенью чувствительности к действию ДТ обладает
культура клеток почек зеленых мартышек - перевиваемая
линия 4647 [50]. На определенных этапах работы с ДТ ККЛ
может полностью заменить морских свинок, на других -
резко сократить их количество [18, 50, 51].
Во многих странах, занимающихся производством имму-
нобиологи-ческих препаратов, коклюшная вакцина - препа-
рат "нового поколения" - приготовлен по современной
технологии из высокоочищенного коклюшного токсина (КТ).
Все процедуры по определению активности КТ, выявлению
возможных остаточных количеств в готовой вакцине и дру-
гие этапы ничем не отличаются от вышеописанных [52].
Внедрение ККЛ для определения патогенных свойств
возбудителей бактериальных инфекций значительно расши-
рило возможности международной эпидемиологической прак-
тики.
ККЛ в генетике и онкологии - в тех областях, где
клеточный подход in vitro не нуждается в разъяснении
или пропаганде: изучение болезней крови немыслимо без
тщательного анализа клеток крови, клеточной популяции и
степени дифференцировки клеток и др. Можно приводить
бесконечное множество примеров о необходимости клеточ-
ного (цитологического) анализа наследственных болезней
[44, 45, 53, 54]. Спонтанно абортированные зародыши мо-
гут быть изучены только гистологически, либо на клеточ-
ном уровне [44, 45, 53]. Введение клеток зародыша в
культуру тем самым позволяет изучить генетическую эмб-
риональную патологию и биохимическими, и иммунохимичес-
кими методами. Культивируемые клетки эмбриона обеспечи-
вают возможность и биохимической диагностики наследс-
твенных дефектов метаболизма, что относится к пре-на-
тальным клиническим исследованиям.
Для медико-генетических исследований применяют в ос-
новном фи-бробласты. Фибробласты, как известно, предс-
тавляют собой основные клеточные элементы соединитель-
ной ткани. Этот тип клеток хорошо изучен как в условиях
in vivo, так и in vitro. Доказано, что свойства фиброб-
ластов, введенных в культуру, полностью соответствуют
их "правилам поведения" в организме [44, 46, 55]. Полу-
чают фибробласты из эмбрионального материала или из би-
опсированной кожи пациента. Несмотря на то, что достиг-
нуты большие успехи в культивировании самых
разнообразных типов клеток, основным объектом клеточной
генетики остаются соматические, среди них - фиброблас-
ты.
Одно из основных понятий клеточной генетики - "кле-
точный фенотип". Соматические клетки в этой области
важны для анализов потому, что они "отражают фенотип
организма, производят его in vitro на протяжении многих
пассажей" [44, с. 75]. В культивируемых клетках фикси-
руются не только морфологические аномалии, характеризу-
ющие конкретную болезнь, но и физиологические. Напри-
мер, уменьшение продолжительности жизни в ряду пассажей
или снижение эффективности клонообразования можно наб-
людать при синдроме преждевременного старения [44, 46,
53]. В культуре фибробластов, полученных от конкретных
доноров, можно продемонстрировать не только болезни со-
единительной ткани, но и заболевания, поражающие другие
ткани и органы:
хорею Гентингтона, синдром Гарднера, сахарный диабет
и т. д. Большое количество ферментопатий проявляется в
культивируемых фибробластах. Так, культивирование кле-
ток в течение последних нескольких десятилетий вошло в
практику медико-генетического консультирования: для ди-
агностики хромосомных нарушений в пренатальном и пост-
натальном периодах, а также для биохимической диагнос-
тики целого ряда метаболических нарушений, в их числе -
ферментопатий [44, 46, 53, 54].
ККЛ в онкологии широко используется для изучения
клеточно-мо-лекулярных механизмов канцерогенеза, для
тестирования потенциальных канцерогенов, для скрининга
противораковых лекарств и антимутагенов. Можно предска-
зать опасность мутагенного действия для организма, ис-
ходя из экспериментов in vitro. Например, известно, что
вещества, которые привносят двойные разрывы на каждой
нити ДНК в клетках in vitro, в 80% случаев - мутагены
на уровне высших организмов [25, 55]. Есть тесты не
только на клетках in vitro, но на изолированной ДНК. По
нему также прогнозируют мутагенную активность для це-
лостного организма [42, 43, 55].
Неопластическая трансформация клеток есть генетичес-
ки обусловленное изменение нормальных реакций клеток на
неблагоприятные внешние воздействия [25, 42, 43, 55].
Накопление в тканях и органах клеток с измененными ре-
акциями (например, в месте инъекционного введения любо-
го лекарственного средства) - основа патологических
процессов, называемых новообразованием (неоплазиями). К
типичным новообразованиям относятся все типы истинных
опухолей и лейкозов. В одной из приводимых публикаций
[55] на основании собственных данных и обширной литера-
туры отечественных и зарубежных авторов очень подробно
рассмотрены общие закономерности поведения нормальных и
неопластических клеток в организме и в условиях in vit-
ro.
Онкологические исследования обязательно предусматри-
вают применение тестов in vitro вместо животных, заме-
няя или дополняя их, получая более достоверные резуль-
таты. По словам одного из отечественных онкологов: "гу-
манный принцип биологов должен помнить, что животные
должны использоваться для экспериментов в медицине
только тогда, когда это нужно; подчас опыты на животных
в медицине ставятся там, где в этом нет особой необхо-
димости" [25, с. 28].
Кстати говоря, интерес к изучению ДНК опухолевых
клеток возник после создания Л. А. Зильбером (вирусоло-
гом!) вирусо-генети-ческой теории канцерогенеза [56] и
расшифровки Уотсоном и Криком физико-химических основ
наследственности [57]. Эти фундаментальные работы, про-
веденные также в значительной степени на модельных сис-
темах in vitro, стимулировали развитие физико-химичес-
ких и кинетических подходов к изучению состояния генома
клеток под воздействием вредных факторов и механизмов
злокачественного роста [25, 55-59]. Необратимость про-
цесса неопластической трансформации в известной мере
определяется появлением автономности клеток опухоли и
их выходом из-под влияния регулирующих систем организ-
ма. Конечно, наш организм располагает такими силами,
которые достаточно надежно его оберегают. Однако они
небеспредельны. И "участие всех клеток здорового орга-
низма в правильном функционировании их сообщества пре-
рывается неповиновением одной из них. А для сообщества
это становится угрожающим, так как потомство клет-
ки-бунтаря разделяет ее неповиновение. Более того, оно
наследует это неповиновение и даже усиливает его, обра-
зуя "банды" клонов, все более "дикие"" [60, с. 89].
Экспериментальное предвидение опасности в связи с
летальным, сублетальным, обратимым или необратимым по-
ражением клеток может быть достигнуто путем моделирова-
ния таких процессов в экспериментах in vitro [1-6,
43-46, 55, 58, 60]. Патологическое состояние клеток,
изменение их нормальных свойств практически нереально
проследить в целом организме. Однако если такие измене-
ния будут индуцированы даже в незначительном количестве
клеток, то совершенно необходимо знание дальнейшей их
судьбы.
ККЛ в иммунологии, помимо исследовательских задач,
повсеместно применяется в клинической диагностике [18,
28, 60-62]. Все методы клеточного иммунитета in vitro
условно делятся на четыре группы [28]. В конце 60-х го-
дов было известно уже 40 способов определения иммунного
статуса [28]. Эти методики были переведены на русский
язык в 1974 г. [28] с предисловием о том, что "они пос-
лужат прекрасным руководством для иммунологов, инфекци-
онистов, онкологов, биологов и врачей многих специаль-
ностей - всех тех, кто занимается вопросами теоретичес-
кой и прикладной иммунологии". Однако все осталось бла-
гими пожеланиями. Более того, продолжается, например,
массово-тотальная практика постановки антительной пробы
- реакции Манту, не in vitro, а на детях, хотя известно
и другое - "антитела не влияют на устойчивость макроор-
ганизма к туберкулезу... необходимо четко разграничи-
вать роль клеточного и гуморального иммунитета и оцени-
вать относительное значение каждого из них" [18, с. 5,
66]. Другими словами, в практике отечественного здраво-
охранения осуществляется заведомо неэффективная диаг-
ностика.
Показатели клеточного иммунитета, определяемые в куль-
туре лимфоцитов, важны в связи с тем, что они
- дают информацию, подтверждающую или обесценивающую
результаты кожных проб;
- позволяют раздельно анализировать функциональную
способность каждой клеточной популяции (Т - В-лимфоци-
тов);
- устанавливают и различают истинный дефицит Т-кле-
ток от блокирования функции этих клеток гуморальными -
антительными факторами;
- устраняют необходимость введения антигена - вак-
цин, анатоксинов, а заболевшим - специфических сыворо-
ток в тех случаях, когда это нежелательно с медицинской
или этической точек зрения [28, с. 60].
Клеточные иммунные реакции, определяемые in vitro,
это - постоянный контроль иммунного статуса человека в
динамике. Так, назначение иммунодепрессивных средств
без знаний иммунограммы пациента может повлечь за собой
роковые последствия. А трансплантация органов?
Отсутствие адекватного метода контроля за иммуноло-
гическим статусом в процессе сенсибилизации типа вакци-
нации может приводить к парадоксальным реакциям: гипе-
риммунизации или снижению естественного иммунитета, к
отсутствию "нужного" специфического ответа, а также к
заражению живыми вакцинами. Без обследования до и после
прививок неизвестна фактически невосприимчивая катего-
рия лиц к той или другой инфекции. Без критериев "рабо-
ты" иммунокомпетентных клеток нельзя определить иммуно-
дефицитное состояние, являющееся одним из противопока-
заний к введению вакцин, прежде всего - живых [18, 26].
Нереально решать проблемы экологии человека, не зная
иммунного статуса каждого россиянина [18, 26, 53-56,
59-62].
Многие неинфекционные заболевания, возникающие в
современных условиях, резко снижают защитные силы орга-
низма, и, наоборот, иммунодефицит приводит к многочис-
ленным ранее неизвестным болезням [18, 28, 44-46,
56-63].
В бывшем СССР утверждены "Методические материалы по
экспериментальному (фармакологическому) и клиническому
испытанию им-муномодулирующего действия фармакологичес-
ких средств" (Минздрав, Фармкомитет СССР, М., 1984).
Отвлечемся от не очень понятного названия. Первое, на
что обращаешь внимание - на наличие таких разработок
для лекарственных фармакологических средств и отсутс-
твие каких-либо намеков на это у иммунопрепаратов -
вакцин и анатоксинов. Второе, в методах лабораторного
исследования (с. 27) рекомендуется "брать кровь из лок-
тевой вены из расчета 10 мл крови". Почему 10 мл (!), а
не 0,1-1 мл, как принято "во всем мире"? Третье - "Эти
тесты доступны, не требуют большого количества дефицит-
ных реактивов и могут быть осуществлены в условиях кли-
нической лаборатории многопрофильной или специализиро-
ванной больницы. Информативность их достаточно высокая"
[64, с. 25]. Последнее вообще из области фантастики,
поскольку доступны они были раньше, да и теперь, исклю-
чительно медицине типа 4-го управления именно из-за де-
фицитных реактивов.
Вместе с тем, иммунограмма пациента совершенно необ-
ходима хирургам, тем более, хирургам-трансплантологам,
генетикам и иммуноге-нетикам, гематологам и онкологам,
акушерам-гинекологам, фтизиатрам, педиатрам, инфекцио-
нистам и эпидемиологам и т. д.
Как можно ориентироваться на ответную реакцию иммун-
ного статуса конкретного человека, если отсутствуют его
исходные данные? Тем более, когда речь идет о "клини-
ческих испытаниях фармакологических средств" на боль-
ных. Имеются "все основания утверждать, что выраженная
устойчивость ко многим болезням человека зависит в ос-
новном (или даже полностью) от клеточного иммунитета...
применение современных иммунологических методов в кли-
нических исследованиях, направленных на решение проблем
конкретной болезни, дает очень большую экономическую
пользу" [18, с. 67-68].
Без "методов изучения in vitro клеточного иммуните-
та" [28], без иммунограммы на каждого человека ни одна
система здравоохранения не может соответствовать высо-
кому научному уровню и современной клинической практи-
ке.
ККЛ в токсикологии используется как инструмент с
целью экспертизы, прогноза и поиска менее токсичных из-
делий: готовых лекарственных форм, добавок к ним и пи-
щевым продуктам, косметических средств - готовых форм и
их отдельных компонентов; биоцидов - дезинфектантов и
стерилизующих средств, предназначенных для изделий ме-
дицинского назначения; токсичности самих предметов ме-
дицинского назначения: резиновых и пластиковых эндоско-
пов, катетеров, дренажей, шприцев, биопротезов, шовного
материала и др.; промышленных изделий: упаковок, детс-
ких игрушек, хлопчатобумажной материи и шерсти и т.д.;
в гигиене и охране окружающей среды: токсичности воды,
выхлопных газов, промышленных стоков, электрических и
магнитных полей, разного типа излучений; деревообраба-
тывающей промышленности, полимерных и синтетических ма-
териалов, используемых в жилых домах, в детских учреж-
дениях - всего, попадающего в контакт с человеком в бы-
ту и на производстве. Важной необходимостью современных
медико-биологических исследований является междисципли-
нарный подход, совместная попытка нескольких самостоя-
тельных отраслей проникнуть в области, не полностью
доступные каждой в отдельности. Экспериментальные дан-
ные, порой кажущиеся разрозненными, при системном ана-
лизе с взаимодополняющими факторами, отражающими разные
стороны единого процесса, помогают получить логическое
завершение. ККЛ объединяет и стимулирует эти стремле-
ния, способствуя взаимному обогащению разных дисциплин.
Проявления токсического эффекта многообразны [17,
18, 26, 42, 43, 55], происходят они по крайней мере на
трех уровнях: на ор-ганно-тканевом, клеточном и субкле-
точном. Наиболее типичные формы токсического действия
можно прогнозировать в ККЛ разного вида
и происхождения. К ним относятся летальные, сублеталь-
ные и скрытые повреждения клеток, выражающиеся в тормо-
жении роста, их адгезивной способности (прикрепление к
стеклу, пластику), угнетении синтеза РНК, ДНК, фермен-
тативной активности.
Все больше лабораторий мира тестируют общую токсич-
ность с помощью ККЛ. Некоторые из них используют диффе-
ренцированные клетки, такие как клетки печени, эндоте-
лия или сосудов человека, клетки инти-мы аорты человека
и др. Но большинство исследований осуществляется на ме-
нее дифференцированных клетках, которые проще культиви-
ровать. Такие ККЛ применяют для скрининга токсичности
лекарственных и косметических средств, добавок и краси-
телей в продукты питания, пластических материалов и
многого другого.
ККЛ стимулируют развитие новых стратегий в оценке
токсичности. Одна из них - обоснованный выбор клеточной
линии, например, ди-плоидных эмбриональных фибробластов
человека [1, 4-6, 42, 46, 49]. Или линий клеток рогови-
цы глаза для скрининга локальной токсичности. Другая
стратегия - использование батареи тестов с различными
типами ККЛ для того, чтобы изучить большую часть аспек-
тов повреждения [1, 2, 42]. Третья - проведение базовых
исследований по фундаментальным механизмам токсичности
для того, чтобы участвовать в создании международного
банка данных по рациональному использованию разных ти-
пов ККЛ [1, 4-6, 42, 49, 65].
В ККЛ определяется отсутствие токсичности стекла:
пробирок, пипеток, пластиковых микропанелей и других
приспособлений, с которыми контактируют клетки в про-
цессе их культивирования и эксперимента, а также тща-
тельность очистки воды.
В ККЛ изучается токсичность сывороток и плазмы.
Напомним, что остаточные количества химических ве-
ществ-инак-тиваторов, необходимых в процессе изготовле-
ния убитых вакцин, не должны превышать показатель ЦТД в
ККЛ 1:4 - разведение дозы, однократно вводимой человеку
[18].